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篇1

【關(guān)鍵詞】 黑色素瘤抗原；MAGE-A9；RT-PCR；基因克??；基因表達(dá)

Construction of MAGE-A9 gene prokaryotic expression system and its expression in hepatocellular carcinoma

XU Lu，ZHU Jin，QIU Zhen-ning, et al. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

【Abstract】

Objective Its to clone human MAGE-A9 cDNA ，to express its recombinant protein in E. coli and to examine the expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens.Methods The cDNA encoding human MAGE-A9 gene was amplified by RT-PCR from human hepatocelluar carcinoma tissue before the MAGE-A9 gene was inserted into plasmids pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/gIII to construct the recombinant expression vector pBAD/gIII-MAGE-A9 and was transformed into E. coli TOP10．The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay.Results The sequence of MAGE-A9 was identical to the sequence from GenBank. By affinity column and SDS-PAGE , the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35 000． Anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was procuced. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected on 8 cases out of 39 (21%) hepatocellular carcinoma specimens.Conclusion MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens , these patients might be suitable candidates for immune involving antigen encoded by MAGE-A9 gene.

【Key words】 Melanoma antigen ; MAGE-A9; RT-PCR; Gene cloning; Gene expression

MAGE-A（melanoma antigen A）基因是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)抗原，這類抗原在正常組織中除和胎盤組織外均不表達(dá),但在某些惡性腫瘤組織高度特異性表達(dá),同時(shí)它們經(jīng)MHC-Ⅰ類分子遞呈到細(xì)胞表面后,可為自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 識(shí)別［1］,因

而是一種CTL介導(dǎo)的特異性免疫治療的理想靶分

子［2］。迄今已知MAGE-A基因家族成員達(dá)12個(gè)，各成員間的同源性較高。而肝細(xì)胞癌在我國發(fā)病率高，臨床療效及預(yù)后均很不理想，近來針對(duì)肝細(xì)胞癌的免疫治療成為研究熱點(diǎn)。

MAGE-1A9 cDNA 全長945 bp,編碼分子量約35 Kd的蛋白產(chǎn)物。本文通過克隆、表達(dá)肝細(xì)胞癌MAGE-A9基因，制備抗MAGE-A9的單克隆抗體，觀察MAGE-A9基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及定位，為進(jìn)一步進(jìn)行MAGE-A9基因的功能研究及肝細(xì)胞癌的免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。肝細(xì)胞癌手術(shù)切除新鮮標(biāo)本1例，取自江蘇省腫瘤醫(yī)院住院患者，液氮保存。肝細(xì)胞癌蠟塊標(biāo)本39例，其中38例取自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，1例取自江蘇省腫瘤醫(yī)院病理科，男性共36例，女性3例，年齡31～74歲。大腸桿菌菌株TG1及Top10由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pMD18-T購自大連寶生物公司，pBAD/gIII 載體購自美國Invitrogen公司。PCR試劑，ExTaq酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III, T4 DNA連接酶,等購自大連寶生物公司； Hitrap鎳親合柱購自美國Amersham公司； ABC免疫組化試劑盒購自美國Vector公司。

1．2 方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中MAGE-A9基因序列設(shè)計(jì)引物P1：5CACAAGCTTCGGACTCC CTCTTCCTCCTCTCT 3；P2：5CCGGAATTCGAATGT CTCTTGAGCAGAGGAGT 3，分別引入Hind III 和EcoR I酶切位點(diǎn),由北京賽百盛公司合成。

1．2．2 肝癌組織總RNA制備及RT-PCR擴(kuò)增 Trizol一步法提取肝癌組織總RNA，將抽提產(chǎn)物溶于DEPC處理的雙蒸水中，以P1和P2為引物作RT-PCR擴(kuò)增:94 ℃ 4 min預(yù)變性，94 ℃ 50 s變性，58 ℃ 50 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．3 MAGE-A9基因的克隆 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化, 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行T-A克隆重組, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,藍(lán)白斑篩選陽性克隆, PCR初步鑒定陽性克隆后,進(jìn)行DNA 序列分析。堿裂解法提取陽性重組體pMD18-T- MAGE-A9質(zhì)粒, 用EcoR I、 Hind III 酶切, 酶切產(chǎn)物與同樣酶切的表達(dá)載體pBAD/gIII用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,氨芐平板篩選陽性克隆。提取陽性克隆菌質(zhì)粒,以EcoR I、Hind III 酶切, 1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定陽性克隆,所得重組質(zhì)粒命名為pBAD/gIII-MAGE-A9。

1．2．4 MAGE-A9基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 取1μl質(zhì)粒pBAD/gIII-M9轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10, 氨芐平板篩選. 挑取單個(gè)陽性克隆培養(yǎng)至A600 nm=0．5,加入左旋阿拉伯糖(終濃度為0．002%)，于37 ℃

劇烈震蕩誘導(dǎo)表達(dá)4 h后收菌,PBS 重懸,超聲裂解,低溫離心,取上清。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎,離心，上清經(jīng)Hitrap鎳親和柱吸附, 樣品過柱, 以含有0．2、0．3、0．4和0．5 M咪唑的洗脫液依次洗柱，收集純化液, 行12％SDS-PAGE電泳，分析最佳的咪唑洗脫濃度。

1．2．5 單抗制備 常規(guī)雜交瘤法制備單抗。腹腔注射100 μg MAGE-A9蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，對(duì)數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞和免疫小鼠的脾細(xì)胞按常規(guī)PEG方法融合,有限稀釋法克隆細(xì)胞。ELISA法檢測雜交瘤培養(yǎng)上清,陽性細(xì)胞連續(xù)亞克隆,直至陽性率達(dá)到100%，確定為穩(wěn)定的細(xì)胞株。

1．2．6 免疫組化 肝細(xì)胞癌石蠟切片4～5 μm，常規(guī)乙醇脫蠟至水，0．01%檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，2%二抗動(dòng)物（馬）血清封閉,以本實(shí)驗(yàn)制備的抗MAGE-A9雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，常規(guī)ABC法染色，DAB顯色。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2．1 RT-PCR擴(kuò)增MAGE-A9基因 采用RT-PCR從人肝細(xì)胞癌組織中擴(kuò)增目的基因,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,可見大小約945 bp 的條帶，見圖1,與945 bp的MAGE-A9基因目的片段大小一致。

注：1:MAGE-A9;2:DL2 000 Marker

圖1

MAGE-A9基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．2 MAGE-A9基因克隆載體的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行T-A克隆，獲得pMD18-T-MAGE-A9重組體，見圖2，經(jīng)藍(lán)／白斑篩選和菌液PCR初步鑒定結(jié)果正確。DNA 序列分析表明質(zhì)粒為MAGE-A9基因的克隆,序列與GenBank 報(bào)道序列完全一致。MAGE-A9基因與原核分泌型表達(dá)載體pBAD/gIII經(jīng)EcoR I＋Hind III雙酶切后連接，構(gòu)建MAGE-A9基因的原核分泌型表達(dá)系統(tǒng)pBAD/gIII-MAGE-A9。

注：1: DL15 000 Marker; 2: DL2 000 Marker;3: pMD18-T-MAGE-A9;4: pBAD/gIII-MAGE-A9

圖2

pMD18-T-MAGE-A9及pBAD/gIII-MAGE-A9重組質(zhì)粒酶切鑒定圖譜

2．3 MAGE-A9 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 菌體經(jīng)左旋阿拉伯糖誘導(dǎo)，冰凍超聲裂解離心后，取上清行SDS-PAGE，結(jié)果見圖3，與空載菌對(duì)比，在分子量約35 Kd的位置有明顯表達(dá)條帶，符合MAGE-A9基因945 bp片段編碼315個(gè)氨基酸的蛋白分子質(zhì)量。用HiTrap鎳親和柱純化帶有(His)6尾的重組蛋白，洗脫液咪唑濃度從0．2～0．5 M，純化液行12％SDS-PAGE電泳。洗脫最佳咪唑濃度為0．4 M。

注：1-4:純化的MAGE-A9（純化咪唑濃度從0．2~0．5 M）；5:Marker；6:空載細(xì)菌；7:誘導(dǎo)表達(dá)的菌體蛋白

圖3

SDS-PAGE 鑒定MAGE-A9蛋白的表達(dá)和純化

2．4 抗MAGE-A9單克隆抗體的制備和鑒定 間接ELISA法檢測雜交瘤培養(yǎng)上清，經(jīng)3次亞克隆，陽性率達(dá)100%。Western blot法檢測單抗與MAGE-A9的結(jié)合，結(jié)果 見圖4。

注：1：細(xì)菌空載； 2:MAGE-A9 protein;3: Marker

圖4

Western blotting 鑒定MAGE-A9 單抗

2．5 MAGE-A9在肝癌組織的定位觀察 陽性表達(dá)表現(xiàn)為癌細(xì)胞胞漿被染成棕紅色 見圖5，非癌肝細(xì)胞未著色。39例肝細(xì)胞癌，陽性表達(dá)8例，陰性31例，陽性表達(dá)率為21%。MAGE-A9基因的表達(dá)與部分臨床指標(biāo)的關(guān)系見表1。

注：左圖為陽性癌細(xì)胞胞漿染成棕褐色，右圖為非肝癌細(xì)胞未著色

圖5

肝細(xì)胞癌MAGE-A9基因表達(dá)產(chǎn)物定位觀察。（DAB顯色， 400×）

注：采用u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P>0．05;MAGE-A9的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無相關(guān)性

3 討論

尋找合適的腫瘤抗原一直是腫瘤免疫治療的難題。自20世紀(jì)50年代以來，科研工作者陸續(xù)在以黑色素瘤為主的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一些腫瘤相關(guān)抗原，從而成為腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。應(yīng)用MAGE-A1基因作為疫苗應(yīng)用于腫瘤治療的探索性研究較多:

①用MAGE-A1抗原肽疫苗誘導(dǎo)擴(kuò)增特異性CTL進(jìn)行過繼免疫治療［2］；②用人工合成的MAGE-A1抗原肽脈沖處理樹突狀細(xì)胞(DC)或用MAGE-A1基因修飾的DC制成DC疫苗,對(duì)腫瘤患者進(jìn)行免疫治療［3］。而繼MAGE-A1基因第一個(gè)從黑色素瘤細(xì)胞克隆后,目前已發(fā)現(xiàn)12個(gè)MAGE-A成員并形成一個(gè)家族。由于MAGE-A抗原為許多腫瘤所共有,并具有嚴(yán)格的腫瘤表達(dá)特異性,因此MAGE-A

家族分子被視為腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)［1］。

MAGE-A9是MAGE-A亞家族成員, 由于MAGE-A家族中的部分基因已成為良好的腫瘤靶基因，同時(shí)MAGE-A家族基因之間有較高的同源性，故MAGE-A9有可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。因此, 對(duì)MAGE-A9基因進(jìn)行克隆、表達(dá),制備特異性單抗，明確其在肝癌中表達(dá)及定位，這不但有助于對(duì)MAGE-A9基因功能的研究，對(duì)肝癌的免疫治療也具有重要意義。

本研究利用RT-PCR 方法,從人肝癌組織中克隆出目的基因全長片段,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pBAD/gIII-MAGE-A9，通過細(xì)胞融合技術(shù)，制備了一株抗MAGE-A9分子的單克隆抗體，證實(shí)可與MAGE-A9分子特異性結(jié)合。在以往研究中，由于缺乏特異性單抗，很多腫瘤因子的表達(dá)都是基因水平的研究，關(guān)于MAGE-A9在腫瘤中的表達(dá)研究也不例外［4］，包括MAGE-A9在食管腺癌相關(guān)的Barrett食道中過表達(dá)［5］，在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤陽性表達(dá)率27%［6］。但基因與蛋白水平的表達(dá)并不完全一致，更重要的是，腫瘤免疫治療是以抗原的確切定位為基礎(chǔ)的。本文在制備了抗MAGE-A9單克隆抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組化技術(shù)，首次證實(shí)MAGE-A9抗原在肝癌癌細(xì)胞中主要表達(dá)在胞漿，未見同一標(biāo)本中部分腫瘤細(xì)胞MAGE-A9抗原陽性而另一部分腫瘤細(xì)胞MAGE-A9 抗原陰性的情況,只是見標(biāo)本中全部腫瘤細(xì)胞MAGE-A9 抗原陽性或全部陰性，這提示,選用MAGE-A9 基因產(chǎn)物作為靶分子對(duì)陽性患者進(jìn)行免疫治療有可能對(duì)全部的腫瘤細(xì)胞都產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，認(rèn)為MAGE-A9在肝癌中的表達(dá)于患者年齡、性別、腫瘤大小和分化程度沒有相關(guān)性，與趙海濤等檢測MAGE-A10在肝癌中的表達(dá)與臨床病理未見相關(guān)性的結(jié)果相一致［8］。本實(shí)驗(yàn)陽性表達(dá)率為21%（8/39），相比MAGE-A1、MAGE-A10等其他MAGE-A家族抗原在肝癌中超過50%［7，8］的表達(dá)偏低，可能與以下幾方面原因有關(guān)：①以往研究以RT-PCR法檢測基因表達(dá)居多，而本實(shí)驗(yàn)采用的是免疫組化法，在方法上可能會(huì)存在差異；②肝癌標(biāo)本代表性不足，本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量不多，均為肝癌原發(fā)灶標(biāo)本，未涉及肝癌轉(zhuǎn)移灶，且多為中等分化程度的，分化程度較高和較低的肝癌標(biāo)本基本未包括，亦未收集到不伴慢性肝炎的肝細(xì)胞癌標(biāo)本。今后的研究需擴(kuò)大樣本，同時(shí)檢測MAGE-A9在常用的人肝癌細(xì)胞株（如SMMC-7721、BEL-7402、HepG2等）中的表達(dá)情況。

參考文獻(xiàn)

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篇2

【關(guān)鍵詞】皮膚鱗狀細(xì)胞癌;細(xì)胞周期蛋白;cyclin E;表達(dá)

【中圖分類號(hào)】R739.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1006-1959(2009)09-0007-01

2005年2月到2009年4月采用免疫組織化學(xué)法觀察32例皮膚鱗狀細(xì)胞癌中Cyclin E的表達(dá),并進(jìn)行相關(guān)性分析,探討其在皮膚鱗狀細(xì)胞癌是表達(dá)異常的意義及其與皮膚生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料:皮膚鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本為我院2005年2月到2009年4月經(jīng)病理確診存檔的32例石蠟包埋組織(觀察組),其中男26例,女6例,年齡40-90歲,平均年齡(54.5±12.5)歲。皮損部位:頭面部10例,下唇部1例,軀干部5例,下肢5例,會(huì)10例,足部1例。病理分級(jí)按WHO標(biāo)準(zhǔn),I級(jí)7例,Ⅱ級(jí)15例,Ⅲ級(jí)10例。對(duì)照組為外科手術(shù)中剔除的32例正常皮膚組織。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

1.2.1 試劑及儀器。一抗:鼠抗人Cyclin E單克隆抗體,免疫組織化學(xué)SP試劑盒(生工生物工程公司,武漢)。

1.2.2 染色方法:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后,經(jīng)高壓鍋熱處理修復(fù)抗原,4% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗,10%正常羊血清封閉20min,滴加PBS稀釋的Cyciin E工作液,室溫2h,PBS洗3次,再分別加鼠抗人Cyclin E單克隆抗體及SABC復(fù)合物室溫各孵育30min,兩次孵育后均用PBS洗3次;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果觀察及判定標(biāo)準(zhǔn):Cyclin E蛋白陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒。在高倍鏡下取5-8個(gè)視野觀察,計(jì)數(shù)500個(gè)以上細(xì)胞并計(jì)算Cyclin E陽性細(xì)胞百分率,以Cyclin E陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)>5%為Cyclin E蛋白過表達(dá)。Cyclin E蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果均經(jīng)重復(fù)染色一次印證,兩位獨(dú)立觀察者分別觀察計(jì)數(shù)并取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS15.0程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±S>x),若是正態(tài)分布,用方差分析,組間、組內(nèi)比較;若是非正態(tài)分布,用秩和檢驗(yàn)。以P

2 結(jié)果

在對(duì)照組皮膚細(xì)胞核內(nèi)未見陽性表達(dá);在觀察組鱗癌組織中表達(dá)定位于細(xì)胞核,呈棕黃色,陽性染色細(xì)胞散在分布于表皮組織中。Cyclin E在鱗癌組織中陽性表達(dá)較正常人對(duì)照組高,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

3 討論

當(dāng)前細(xì)胞周期中存在幾個(gè)重要關(guān)卡(checkpoint),并受一些細(xì)胞周期蛋白調(diào)控,當(dāng)控制這些關(guān)卡的基因異常表達(dá)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白時(shí),可造成基因組不穩(wěn)或靜止的細(xì)胞越過這些關(guān)卡,引起細(xì)胞周期失控,導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖。 G1向S轉(zhuǎn)變是細(xì)胞周期主要調(diào)控點(diǎn)之一,目前發(fā)現(xiàn)G1期的調(diào)節(jié)因子與癌變關(guān)系最密切。細(xì)胞周期調(diào)控涉及細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI),以CDK的活性表達(dá)與調(diào)控為主。已證實(shí),作為一種細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)是一種癌基因, Cyclin E的正調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。Cyclin E表達(dá)在G1晚期達(dá)高峰,是G1/S期轉(zhuǎn)換的限速因子,其過度表達(dá)可加速細(xì)胞進(jìn)入S期,導(dǎo)致細(xì)胞無限制增殖,并進(jìn)一步引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CyclinE是1991年美國的研究小組在篩選人cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。由4個(gè)外顯子3個(gè)內(nèi)含子組成,轉(zhuǎn)錄2.2 kb的mRNA,編碼395個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子質(zhì)量50ku。Cyclin E的合成在G1晚期達(dá)高峰,繼CyclinD后被活化,然后經(jīng)與PEST序列有關(guān)的蛋白水解或泛素路徑降解而迅速下降。因此,CyclinE主要在G1晚期發(fā)揮正性調(diào)控細(xì)胞周期的作用。

Mullerw等研究表明在一大部分早期NSCLC患者中Cyclin E的mRNA水平升高。Geng等研究了87例乳腺癌患者,其中21例有Cyclin E mRNA的高表達(dá),約占24%,雌激素受體陽性及陰性的頻率大致相當(dāng)。一大部分Cyclin E過表達(dá)的人乳腺癌同時(shí)過表達(dá)周期蛋白E mRNA。Payton等發(fā)現(xiàn)肺癌和乳腺癌患者原發(fā)腫瘤Cyclin E的表達(dá)升高。肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌Cyclin E2信號(hào)最強(qiáng),其次是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌。雌激素受體缺乏的乳腺腫瘤更容易引起Cyclin E升高,提示Cyclin E可能導(dǎo)致乳腺腫瘤發(fā)病機(jī)理的解偶聯(lián)。本組正常皮膚組織cyclin E無表達(dá),皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織cyclin E陽性表達(dá),且在復(fù)發(fā)腫瘤中及隨病理分級(jí)升高而升高。表明在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的早期,cyclin E陽性表達(dá)逐漸增高,但僅為量變,故其陽性表達(dá)與病理分型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱神經(jīng)侵犯無關(guān);當(dāng)其陽性表達(dá)增至最高點(diǎn),由量變發(fā)生質(zhì)變,細(xì)胞進(jìn)入S期,瘤細(xì)胞進(jìn)入無限增殖期。cyclin E陽性表達(dá)在鼻咽癌患者中的3年生存率差異有顯著性,表明其在判斷鼻咽癌預(yù)后中有參考價(jià)值。

總之,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制,其中Cyclin E的正調(diào)控在此過程中起關(guān)鍵作用。隨著對(duì)Cyclin E作用機(jī)理的深入研究,將為進(jìn)一步闡明皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制帶來曙光,并為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)。

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篇3

【關(guān)鍵詞】 IgG； 肝癌； 臨床病理學(xué)指標(biāo)； 原位雜交； 免疫組織化學(xué)

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and distribution of IgG in human liver cancer cells and its correlation with clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma.Method：Fresh and paraffin-embedded tissues from 60 cases of HCC tumor with the matched normal liver specimens were detected by two-step immunohistochemistry and in situ hybridization for the expression of IgG protein and mRNA respectively. The relationship between cancer-derived IgG expression and 9 clinicopathological factors were analyzed statistically.Result：Signals of IgG protein in hepatocellular carcinoma cancer cells was significantly stronger than that in its corresponding normal tissues （P=0.001）； the over-expression of IgG was negatively correlated with several clinicopathological factors such as tumor differentiation grade and pTNM （r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）， and positively associated with AFP concentration in serum （r=0.336，P=0.009）. However， no correlationship with age， gender， capsular infiltration，tumor size， tumor quantity and recurrence or metastasis of the disease within 1 year was found （P>0.05）. Conclusion：Liver-cancer-derived IgG may has a profound impact on the differentiation and pTNM staging of liver cancer cell， and might be served as a tumour marker to help pathological diagnosis and evaluate the prognosis for patients.

【Key words】 IgG； Liver cancer； Clinical pathological factors； In situ hybridization； Immunohistochemistry

First-author’s address：Weifang Medicial University，Weifang 261053，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.008

近來多項(xiàng)研究證明，乳腺癌、大腸癌、胃癌和肺癌等源于上皮的惡性腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生IgG[1-6]。邱曉彥等[4]最早發(fā)現(xiàn)Ig樣蛋白的表達(dá)與惡性腫瘤的分化有關(guān)；依據(jù)腫瘤的分化程度不同，Ig樣蛋白的表達(dá)水平也不同，即分化程度越高，表達(dá)強(qiáng)度越低，并證實(shí)該Ig樣蛋白為IgG；葉雪等[7]發(fā)現(xiàn)在惡性卵巢上皮性癌中IgG的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常卵巢，IgG的表達(dá)水平與卵巢癌的臨床分期和病理分級(jí)無相關(guān)性；李浩勇等[6]對(duì)膀胱癌研究發(fā)現(xiàn)：膀胱癌細(xì)胞能夠表達(dá)IgG，其抗體體外對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用，且具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)；Niu等[8]研究了IgG的表達(dá)與結(jié)直腸癌的生物學(xué)指標(biāo)和臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，通過siRNA干擾下調(diào)IgG的表達(dá)，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞（LOVO細(xì)胞）的增殖、克隆形成和侵襲能力，提示腫瘤源性IgG具有促進(jìn)腫瘤生長，轉(zhuǎn)移的作用。肝癌亦屬于上皮性惡性腫瘤，但是目前對(duì)于IgG在肝癌組織中的表達(dá)與分布情況及其與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系的研究尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)和原位雜交技術(shù)檢測肝癌組織中IgG的表達(dá)情況，進(jìn)而分析其表達(dá)水平和肝細(xì)胞肝癌9項(xiàng)臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，以期為肝細(xì)胞肝癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和濰坊市民醫(yī)院2010-2012年手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本60例，其中男40例，女20例，平均年齡45歲，患者術(shù)前均未采取任何治療措施。所有肝癌病例隨訪12～18個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的書面許可。所有新鮮標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛/PBS固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。

1.2 免疫組化方法 采用PV-9000兩步法（試劑盒購自美國Zymed公司）進(jìn)行免疫組化檢測。切片常規(guī)脫蠟，入水，枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，經(jīng)3%過氧化氫37 ℃孵育20 min后，滴加小鼠抗人IgG單克隆抗體（1：1000，購自美國sigma公司），4 ℃濕盒過夜，滴加試劑1（聚合物輔助劑），37 ℃孵育30 min，滴加試劑2（辣根過氧化素）標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min。各步驟之間均是PBS沖洗3次，每次5 min。AEC顯色，蘇木素復(fù)染，甘油明膠封片。以手術(shù)切除的扁桃體組織作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 原位雜交方法 切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度透明至PBS反復(fù)沖洗，酶消化，經(jīng)預(yù)雜交，滴 50μL含探針的雜交液，45 ℃保溫，20 h。將切片浸泡于5×SSC（37 ℃）中，后依次經(jīng)5%甲酰胺2×SSC（37 ℃）清洗15 min。PBS Buffer Ⅰ漂洗一次后，滴加50 μL馬血清封閉液，置濕暗盒中室溫1 h。后滴加Anti-Dig-Ab（1∶100，購自瑞士roche公司），室溫1 h后BufferⅠ、Ⅱ液依次漂洗數(shù)次，NBT-BCIP顯色。以結(jié)腸黏膜下孤立淋巴結(jié)作為陽性對(duì)照，以IgG正義探針代替反義探針作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)分 采用雙盲法，由3位病理學(xué)教授在400×的顯微放大倍數(shù)下隨機(jī)對(duì)染色切片獨(dú)立評(píng)分，所得平均分作為最終結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）陽性細(xì)胞數(shù)所占比例：小于5%為0，5%～25%為1，25%～50%為2，大于50%為3；（2）染色強(qiáng)度：未著色為0，淡紅色或粉紅色為1，紅色為2，深紅色為3。兩項(xiàng)測量標(biāo)準(zhǔn)得分之和為0～3分的切片標(biāo)記為弱染色，陰性；4～6分的切片標(biāo)記為強(qiáng)染色，陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用Pearson 字2及Fisher確切概率法檢驗(yàn)分析，評(píng)估IgG的表達(dá)情況與臨床病理學(xué)參數(shù)（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤分化程度、AFP濃度、pTNM分期、1年內(nèi)是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）之間的相關(guān)性。以P

2 結(jié)果

2.1 IgG蛋白在肝癌組織的表達(dá)及免疫組化檢測結(jié)果 經(jīng)免疫組化檢測結(jié)果顯示60例肝癌組織的IgG蛋白陽性率為85.00%（51/60），癌周正常肝組織的陽性率為6.67%（4/60），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。IgG蛋白陽性染色主要定位于肝癌細(xì)胞胞漿和胞膜。

2.2 IgG mRNA在肝癌組織的表達(dá)及原位雜交結(jié)果 IgG mRNA陽性信號(hào)位于肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞胞漿，為藍(lán)紫色，呈顆粒狀，與免疫組化結(jié)果具有良好的一致性，從mRNA水平證實(shí)了肝細(xì)胞肝癌組織自身具有產(chǎn)生IgG的能力。

2.3 IgG在肝癌組織中的表達(dá)和臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 IgG的異常高表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌分化程度和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）；與血漿AFP濃度呈正相關(guān)（r=0.336，P=0.009）；與年齡、性別、腫瘤包膜完整性、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和一年內(nèi)是否復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P>0.05），見表1。

3 討論

免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）是體內(nèi)免疫球蛋白家族中含量最高的一種，在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。經(jīng)典免疫學(xué)理論認(rèn)為IgG僅可由B淋巴細(xì)胞經(jīng)成熟分化過程才能夠特異性合成并分泌。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IgG在其他多種上皮性惡性腫瘤組織和細(xì)胞系中也存在異常高表達(dá)的現(xiàn)象[1-2，5，7-8]。Niu等[8]最近發(fā)現(xiàn)IgG在結(jié)直腸癌組織中和CRC細(xì)胞中高度表達(dá)，而且此高度表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和炎性細(xì)胞浸潤有密切的關(guān)系，提示腫瘤源性IgG可能對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響。有研究顯示在肝細(xì)胞肝癌患者的血漿中和肝癌細(xì)胞系（BCL-7402）中均可檢測到IgG的含量異常增高[2，5，9]。但是在肝癌組織中的表達(dá)情況未有報(bào)道，肝癌細(xì)胞所分泌的IgG的功能未知，其表達(dá)和癌癥的臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系也有待于研究。

在本項(xiàng)研究中，筆者分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平證明了肝癌組織可以產(chǎn)生IgG。IgG在肝癌中的高表達(dá)（85.00%）與腫瘤的分化程度和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)，IgG在分化較差（低分化或未分化）或在處于pTNM Ⅲ～Ⅳ期的肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)比在分化較好（中分化或高分化）或在處于pTNM Ⅰ～Ⅱ期的肝細(xì)胞肝癌組織中更為明顯；IgG的高表達(dá)與血漿AFP濃度呈正相關(guān)，與年齡、性別、腫瘤包膜的完整性、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和一年內(nèi)是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腫瘤源性IgG可能與腫瘤生長有關(guān)。免疫球蛋白能促進(jìn)腫瘤生長的現(xiàn)象已有報(bào)道，這主要與“抗癌抗體”阻斷癌細(xì)胞表面的靶表位有關(guān)[10-13]。Taylor等[14]在研究卵巢癌中發(fā)現(xiàn)異常糖基化的免疫球蛋白分子不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，免疫球蛋白重鏈，T淋巴細(xì)胞受體（例如：TCR-a，TCR-b），免疫球蛋白樣黏附分子（例如：CD47，CD54）均可在癌細(xì)胞中表達(dá)[15]。免疫球蛋白抗體和T淋巴細(xì)胞受體可啟動(dòng)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，致使癌細(xì)胞凋亡。所以免疫蛋白超家族對(duì)于腫瘤細(xì)胞可能具有自身保護(hù)作用，并與癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。邱曉彥等[4]早期研究了3例肝癌組織，其分化程度均為中度，研究結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞中Ig蛋白均具有很高的表達(dá)量，因此認(rèn)為在肝癌組織中IgG的表達(dá)程度與腫瘤的分化無相關(guān)性。而本研究提示IgG在肝癌中的異常表達(dá)與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)。這種差異可能由于樣本量大小不同造成。

甲胎蛋白（AFP）是分子量為64 000～70 000道爾頓的一種糖蛋白，主要由肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成，是胎兒成長發(fā)育的重要蛋白，具有保護(hù)胚胎不受母體排斥的作用。AFP在出生后立即消失，若再次出現(xiàn)則提示肝癌或生殖胚胎癌，因此AFP是肝癌診斷、治療和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。賈戶亮等[16]分析腫瘤數(shù)目、大小和pTNM分期不同的肝細(xì)胞肝癌的患者血清AFP水平顯示，AFP水平的高低與腫瘤的大小、數(shù)目和pTNM分期均呈正相關(guān)，其中pTNM Ⅰ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期以及pTNM Ⅱ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期肝細(xì)胞肝癌患者血清AFP水平具有顯著的差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清AFP水平較高（>400 μg/L）

的肝細(xì)胞肝癌患者組的IgG陽性表達(dá)率（92.8%，39/42），比血清AFP水平較低（≤400 μg/L）的肝細(xì)胞肝癌患者（66.7%，12/18）組顯著增高，與先前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。盡管血清AFP含量水平對(duì)肝癌的早期診斷有重要意義，但是并非所有AFP升高都可以斷定為肝癌，而且并非所有血清AFP含量水平正常就能排除肝癌的可能。在肝炎、肝硬化活動(dòng)灶等疾病中亦可檢測到高水平含量的血清AFP，因此僅僅根據(jù)血清AFP濃度來對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行早期診斷是不夠準(zhǔn)確的[17-18]。所以聯(lián)合腫瘤源性IgG表達(dá)水平的檢測可提高陽性檢出率，降低漏診率和誤診。

綜上所述，在肝癌組織中IgG表達(dá)顯著增高，IgG的表達(dá)水平與腫瘤的分化、分期有著密切的關(guān)系。這可為以后的肝癌的早期診斷和分期判斷提供了又一重要指標(biāo)。研究IgG的表達(dá)與腫瘤的生長分化的關(guān)系，有助于為腫瘤的免疫治療提供理想的理論依據(jù)，但是對(duì)于其功能與分子機(jī)制的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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篇4

[關(guān)鍵詞] T細(xì)胞共刺激分子；T細(xì)胞亞群；胃癌；大腸癌

[中圖分類號(hào)] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）02（a）-0003-03

[Abstract] Objective To discuss and analyze the significance of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups in the expression of gastric carcinoma and colorectal cancer tissues. Methods 41 cases of patients with gastric carcinoma and 39 cases of patients with colorectal cancer treated in our hospital from September 2014 to October 2016 were selected as the research objects and the patients with gastric carcinoma were selected as the group A， while the patients with colorectal cancer were selected as the group B， and 33 cases of healthy persons at the same period were selected as the group C， and the admission persons were tested by the Flow cytometry， and test results of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups of the three groups were compared. Results The T cell co-stimulatory molecule CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（25.81±10.55），（28.94±9.28）% vs （0.81±0.97）%]， and T cell CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（53.62±13.83），（55.95±10.67）% vs （72.06±7.82）%]，the T cell CD4+CD3+ level in the group A and group B was lower than that in the group C[（29.83±9.72），（33.74±9.03）% vs （38.78±5.07）%]， the T cell CD8+CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C， [（1.58±1.98）%，1.92±2.62）% vs（0.04±0.03）%]，the T cell CD8+CD28-CD3+ and CD4/CD8 levels in the group A was lower than that in the group C[（16.07±6.95）， （1.15±0.54）%vs （20.55±6.55），（1.35±0.32）%]， and the T cell CD4+CD25+CD3+ level in the group B was higher than that in the group C[（19.75±6.88）% vs （13.71±3.07）%]， and the difference had statistical significance（P0.05）. Conclusion The T cell number of patients with gastric carcinoma and colorectal cancer obviously decreases， but the expression of CD28 increases， and CD4+T cell number of patients with gastric carcinoma obviously decreases， but the regulatory T cell number of patients with colorectal cancer obviously increases.

[Key words] T cell co-stimulatory molecules； T cell subgroup； Gastric carcinoma； Colorectal cancer

臨床上，腫瘤發(fā)生、發(fā)展同抗腫瘤免疫存在一定的聯(lián)系，抗腫瘤免疫的機(jī)理目前主要有腫瘤細(xì)胞免疫逃逸學(xué)以及免疫監(jiān)視學(xué)[1-3]。為了探討和分析T細(xì)胞共刺激分子及其亞群在胃癌和大腸癌組織中表達(dá)的意義，該次研究方便選擇該院于2014年9月―2016年10月期間收治的41例胃癌患者和39例大腸癌患者作為研究主體，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次研究選擇該院收治的41例胃癌患者和39例大腸癌患者作為研究主體，胃癌患者為甲組，大腸癌患者為乙組，選擇同期進(jìn)行檢測的33名健康人作為丙組。其中甲組患者男性為23例，女性為18例；年齡在43～79歲之間，平均為（59.61±3.15）歲。乙組患者男性為22例，女性為17例；年齡在42～78歲之間，平均為（59.31±3.24）歲。丙組中男性為19名，女性為14名；年齡在41～79歲之間，平均為（58.68±3.61）歲。甲乙丙3組上述資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可對(duì)比。

1.2 方法

在術(shù)前和術(shù)后1周對(duì)甲乙兩組患者進(jìn)行外周靜脈血抽取，抽取量為2 mL，行ETDA3K抗凝。丙組抽取2 mL的外周靜脈血抽取，行ETDA3K抗凝，在室溫下進(jìn)行保存，檢測要在18 h之內(nèi)完成。

取100 μL的血樣全血分別加入熒光標(biāo)記的CD3-Pc5、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD28-FITC單抗和相應(yīng)同型對(duì)照，在室溫下行避光孵育，時(shí)間為25 min左右，之后加入0.5 mL的溶血?jiǎng)?，作用時(shí)間為30 min，加入PBS直到0.5 mL。在混合均勻后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，在檢測前行熒光微球矯正，保證機(jī)器的誤差

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并記錄3組的檢測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

通過SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)此次研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用 t 檢驗(yàn)，以 P

2 結(jié)果

甲乙兩組T細(xì)胞共刺激分子CD28+CD3+水平高于丙組，甲乙兩組T細(xì)胞CD3+水平低于丙組，甲乙兩組T細(xì)胞CD4+CD3+水平低于丙組，甲乙兩組T細(xì)胞CD8+CD28+CD3+水平高于丙組，甲組T細(xì)胞CD8+CD28-CD3+以及CD4/CD8水平低于丙組，乙組T細(xì)胞CD4+CD25+CD3+水平高于丙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見表1、表2。

3 討論

T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤免疫主要效應(yīng)細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞能調(diào)節(jié)和活化上述細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)。Ts細(xì)胞（CD8+CD28-CD3+）組織抗原的呈遞，并可阻斷Th細(xì)胞功能。T細(xì)胞的完全活化是CD28共刺激活化，CD8+CD3-細(xì)胞的亞群參與到了腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)中，同機(jī)體的帶瘤狀態(tài)存在一定關(guān)系[4-7]。此次研究結(jié)果表明，甲乙兩組CD3+、CD4+以及CD8+等T細(xì)胞亞群的表達(dá)都明顯降低，尤其是甲組CD4+降低最為明顯，所以無法發(fā)揮出正?？鼓[瘤的作用；丙組的CD28表達(dá)比較微弱，甲乙兩組增高明顯。甲乙兩組的CD4+、CD8+表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甲乙兩組的CD8+、CD3-較術(shù)前有所增加，但同丙組對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這同傅冷西等[8]的研究結(jié)果： CD28+CD3+表達(dá)：胃癌組（25.80±10.56）%，大腸癌組（28.95±9.29）%，均明顯高于對(duì)照組的（0.82±0.98）%（P

綜上所述，在胃癌患者中T細(xì)胞亞群的異常表現(xiàn)主要為T細(xì)胞共刺激分子（CD28）的無效表達(dá)增加，CD4+T細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。而大腸癌患者的主要特征為CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量增多，所以，T細(xì)胞亞群是腫瘤治療效果以及預(yù)后判斷有效的一個(gè)重要檢測指標(biāo)。

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篇5

［目的］探討口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）發(fā)生、發(fā)展過程中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）對(duì)微血管生成的意義。［方法］采用免疫組化SP法對(duì)65例OSCC、40例非典型增生、22例正?？谇火つみM(jìn)行MMP9、CD34免疫組化染色。檢測OSCC、非典型增生、正?？谇火つぶ蠱MP9的表達(dá)和微血管密度（MVD），并分析MMP9的表達(dá)與MVD之間，以及它們與OSCC臨床病理特征之間的關(guān)系。［結(jié)果］OSCC組中MMP9的表達(dá)與MVD值均高于非典型增生組，在非典型增生組中均高于正?？谇火つそM；OSCC組、非典型增生組和正?？谇火つそM中MMP9表達(dá)與MVD有正相關(guān)趨勢；MMP9的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。［結(jié)論］MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之一。

【關(guān)鍵詞】 口腔鱗狀細(xì)胞癌　免疫組織化學(xué)　基質(zhì)金屬蛋白酶9　CD34

Correlation between Expression of Matrix Metalloproteinase9 and Angiogenesis in Oral Squamous Cell Carcinoma

Abstract: ［Purpose］ To study the significance of matrix metalloproteinases9 (MMP9) on micro angiogenesisin carcinogenesis and progression of oral squamous cell carcinoma (OSCC). ［Methods］MMP9 and CD34 were detected by immunohistochemistry SP method in 22 cases of normal oral mucosa， 40 cases of atypical hyperlasia and 65 cases with OSCC. The expression of MMP9 and microvessel density (MVD) were detected in the three groups and the relationship between expression of MMP9 and MVD and its relationship with OSCC clinicpathological characteristics were reviewed.［Results］ The expression of MMP9 and the level of MVD in OSCC were significantly higher than that in atypical hyperlasia. The expression of MMP9 and the level of MVD in the group of atypical hyperlasia were significantly higher than that in normal oral mucosa. The expression of MMP9 were closely related with MVD in the tumor group， atypical hyperlasia group and normal oral mucosa group. MMP9 expression in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis and tumor size. MVD in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis. ［Conclusion］ MMP9 may be one of important factors in angiogenesis ofOSCC.

Key words: oral squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; matrix metalloproteinases9; CD34

腫瘤內(nèi)新生血管的生成是影響腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的重要因素，近年來的研究表明[1]基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）在腫瘤血管生成中有重要作用，明膠酶是MMPs的一個(gè)亞類，包括基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），其中MMP9與腫瘤血管生成的關(guān)系研究較少，研究結(jié)果也不一致，有關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織中MMP9與腫瘤血管生成的關(guān)系，更少見報(bào)道。本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP9和CD34的表達(dá)，并對(duì)MMP9的表達(dá)與微血管密度（MVD）做定量分析，探討口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP9對(duì)血管生成的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 資料來源

本研究所用石蠟包埋組織標(biāo)本選自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1998年1月至2001年12月的手術(shù)患者?？谇击[狀細(xì)胞癌患者65例，均為作口腔鱗狀細(xì)胞癌根治性手術(shù)的患者，術(shù)前未作放療或化療，術(shù)后經(jīng)病理診斷確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌，男性35例，女性30例，中位年齡45.5歲；腫瘤最大直徑≤3cm者35例，>3cm者30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例；臨床分期為Ⅰ期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例；其中高分化鱗癌18例，中分化鱗癌24例，低分化鱗癌23例?？谇环堑湫驮錾±?0例，來自其他口腔疾患手術(shù)標(biāo)本，正?？谇火つ?2例，取自活檢標(biāo)本，均未做過任何治療。

1.2 方 法

鼠抗人MMP9多克隆抗體和CD34單克隆抗體，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。 所有組織均經(jīng)10%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋， 包埋組織標(biāo)本作4μm連續(xù)切片，免疫組化SP法染色參照試劑說明書進(jìn)行， MMP9、CD34均采用高溫直接煮沸法修復(fù)抗原。用已知的陽性切片作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

⑴MMP9以實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒判斷為陽性著色。定量及圖像分析采用同濟(jì)醫(yī)大千屏影像公司HPLAS1000病理圖像分析系統(tǒng)，將切片上的陽性染色信號(hào)轉(zhuǎn)為灰度進(jìn)行分析。

⑵MVD計(jì)數(shù)，參照Weinder[2]報(bào)道的方法進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，先在低倍鏡（×100）下觀察確定血管密度最高處，在（×200）視野下選擇3個(gè)高血管密度區(qū)，計(jì)算單位視野（×200）平均血管數(shù)。單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，而直徑大于約8個(gè)紅細(xì)胞的血管，有厚肌壁的血管以及硬化區(qū)的血管不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MMP9在正常口腔黏膜組織、非典型增生、OSCC中的表達(dá)和分布

MMP9陽性細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色，偶爾可見細(xì)胞核著色，陽性顆粒多呈團(tuán)塊狀。MMP9在癌組織中于腫瘤細(xì)胞(見圖1)、增生上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有陽性表達(dá)，在血管平滑肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞上也有明顯陽性表達(dá)(見圖2)，MMP9陽性分布呈異質(zhì)性，陽性細(xì)胞多位于癌巢邊緣和管腔周圍，其中基底膜附近的腫瘤細(xì)胞染色尤為明顯。MMP9在非典型增生的表達(dá)主要位于增生上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，在間質(zhì)細(xì)胞中偶見染色。MMP9在正常口腔黏膜組織表達(dá)微弱，僅見于少數(shù)上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中。對(duì)切片的MMP9染色進(jìn)行灰度分析，結(jié)果顯示從正?？谇火つぃ堑湫驮錾絆SCC， MMP9的表達(dá)逐漸增高，OSCC組中MMP9表達(dá)顯著高于非典型增生組織（P

2.2 正?？谇火つそM織、非典型增生、OSCC中MVD的分布

CD34標(biāo)記的微血管呈點(diǎn)狀分布，血管內(nèi)皮細(xì)胞膜被染成褐色。腫瘤組織中的微血管形態(tài)不規(guī)則，部分血管呈現(xiàn)發(fā)芽狀，血管分布不均勻，在腫瘤的邊緣區(qū)域最為密集，呈簇狀(見圖3)。非典型增生組織中微血管形態(tài)較規(guī)則，但分布不均，血管簇偶見。正?？谇火つそM織內(nèi)的微血管形態(tài)規(guī)則，分布均勻。OSCC組中MVD顯著高于非典型增生組織（P

2.3 OSCC中MMP9表達(dá)與OSCC血管生成的關(guān)系

OSCC中MMP9表達(dá)與MVD顯著高于非典型增生組（P

3 討 論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多步驟過程。實(shí)驗(yàn)表明[3]腫瘤組織中微血管密度越大，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)及淋巴循環(huán)的機(jī)會(huì)越多，淋巴結(jié)及鄰近臟器轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)也增大。MMP9由結(jié)締組織細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分泌，是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，在生理情況下維持細(xì)胞外基質(zhì)，在胚胎發(fā)育、組織塑形中起著不可替代的作用。在病理情況下，MMP9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分中的Ⅳ型膠原使得腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)部位正常的基底膜而發(fā)生浸潤，突破脈管周圍的基底膜進(jìn)入脈管系統(tǒng)，即發(fā)生轉(zhuǎn)移。近來研究表明[1，4]，MMP9不僅是降解基底膜和ECM的關(guān)鍵酶，而且在腫瘤間質(zhì)血管生成中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示從正?？谇火つ?，非典型增生到OSCC，MMP9的表達(dá)逐漸增高，在非典型增生MMP9的表達(dá)主要位于增生上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，在癌組織中MMP9在腫瘤細(xì)胞，增生上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有陽性表達(dá)，在表達(dá)的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞的種類、數(shù)量上均高于非典型增生組，提示MMP9可能在OSCC發(fā)生中發(fā)揮作用。同時(shí)觀察到并非所有腫瘤細(xì)胞均能表達(dá)MMP9，具有MMP9表達(dá)能力的腫瘤細(xì)胞多位于這部分細(xì)胞多位于腫瘤的外周部分和毛細(xì)血管淋巴管腔周圍，呈片狀、灶狀分布，提示表達(dá)MMP9的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，符合腫瘤細(xì)胞的侵襲規(guī)律。在本實(shí)驗(yàn)中還觀察到，在毛細(xì)血管腔和淋巴管腔周圍及管腔內(nèi)部可見聚集成團(tuán)狀并深度著色的癌細(xì)胞，可能為遷移到該處的高轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞克隆增殖而成。另外表達(dá)MMP9的腫瘤細(xì)胞附近的血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞上也有明顯陽性表達(dá)，提示該區(qū)域的血管平滑肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在MMP9的表達(dá)上存在著聯(lián)系，分析結(jié)果顯示MMP9在瘤徑>3cm組中的表達(dá)高于瘤徑≤3cm組，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示MMP9可能是OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移的重要促進(jìn)因素。

本實(shí)驗(yàn)中顯示從正常組織非典型增生OSCC，組織中的MVD有逐漸增加趨勢，非典型增生組中的MVD顯著高于正常組，提示細(xì)胞在未發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化之前已有血管生成增多，這一現(xiàn)象是否為OSCC血管生成的啟動(dòng)階段有待于作進(jìn)一步研究。Eisma等[5]對(duì)頭頸部鱗癌研究發(fā)現(xiàn)MVD每增加10個(gè)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)度就增加1.32倍，在本研究中顯示OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MVD顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，由于在OSCC中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)遠(yuǎn)高于血行轉(zhuǎn)移，提示對(duì)OSCC原發(fā)灶MVD檢測有利于作出轉(zhuǎn)移和預(yù)后優(yōu)劣的判斷，但是否能作為OSCC的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素尚需要做進(jìn)一步研究。

大量研究顯示MMPs與腫瘤血管生成關(guān)系密切，在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察發(fā)現(xiàn)MMP9的表達(dá)部位與MVD高密度區(qū)具有一致性，均位于腫瘤細(xì)胞生長活躍的癌巢邊緣地區(qū)，提示：①腫瘤在局外浸潤生長的過程中，新生血管化是同步進(jìn)行的；②MMP9的表達(dá)與腫瘤血管形成有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中我們還觀察到MMP9不僅在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞上MMP9也有表達(dá)，這與MMP9參與腫瘤新生血管形成的觀點(diǎn)一致。有研究顯示[6]腫瘤的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過分泌MMP9降解周圍基質(zhì)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，使自身的血管條索延長和擴(kuò)大，也有研究顯示[7，8]血管生成因子VEGF在促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管形成的同時(shí)，可以通過不同的信號(hào)途徑，促進(jìn)MMP9的表達(dá)并對(duì)TIMP1的表達(dá)進(jìn)行抑制。 這些研究說明MMP9通過多種途徑對(duì)腫瘤新生血管形成起作用，總體上表現(xiàn)出促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明 OSCC中MMP9的表達(dá)顯著高于非典型增生，其MVD也顯著高于非典型增生 ，MMP9的表達(dá)與MVD具有一致性，MMP9與腫瘤新生血管形成關(guān)系密切。

本研究結(jié)果表明MMP9、新生血管形成與OSCC發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之一。阻斷MMP9的表達(dá)，抑制MMP9的活化可能具有抑制OSCC轉(zhuǎn)移和血管生成的雙重意義。

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篇6

[關(guān)鍵詞] 肺腫瘤；化療；Stathmin；β-tubulin-Ⅲ

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）12-0059-03

2011年肺癌NCCN指南中指出：對(duì)于行R0切除的Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），術(shù)后需行輔助化療（一類證據(jù)），但不同患者對(duì)化療的反應(yīng)及預(yù)后差別很大。這可能與個(gè)體的生物學(xué)差異有關(guān)，因此建立循證醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)上，以藥物基因組學(xué)研究為依托的個(gè)體化治療已成為未來NSCLC臨床研究的重要方向。目前研究表明，微管基因是許多抗腫瘤藥物的作用位點(diǎn)，其中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ表達(dá)增高與紫杉醇類藥物的敏感性降低相關(guān)。那么它們的表達(dá)水平與長春堿類藥物療效的關(guān)系怎么樣呢？國內(nèi)外的研究結(jié)果很不一致，甚至自相矛盾[1]。

因此，本文篩選出73例接受手術(shù)且術(shù)后病理明確為Ⅱ期NSCLC患者，術(shù)后均給予長春瑞濱聯(lián)合順鉑輔助化療，并檢測腫瘤組織中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)水平，隨訪患者無瘤生存時(shí)間（DFS）和總體生存時(shí)間（OS），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析蛋白表達(dá)水平與患者DFS和OS的關(guān)系，探討Stathmin及β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)水平與化療藥物療效的相關(guān)性，希望能為個(gè)體化治療方案的制定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及資料收集

所有標(biāo)本均從本院標(biāo)本庫中篩選（所有入標(biāo)本庫患者均簽定知情同意書，醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過）。術(shù)后病理按照2006年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，共篩選2007年9月～2010年6月經(jīng)根治性手術(shù)切除的Ⅱ期NSCLC患者73例?；颊叩呐R床特征：男58例、女15例；年齡≤60歲55例、>60歲18例；腫瘤大小≤3 cm2 2例、>3 cm 51例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鱗癌36例、其他病理類型4例。

1.2 輔助化療

患者術(shù)后轉(zhuǎn)至化療科室進(jìn)行長春瑞濱聯(lián)合順鉑化療，順鉑75 mg/m2分3天給予，長春瑞濱25 mg/m2第1、8天，以上方案每3周重復(fù)。其中1例患者因骨轉(zhuǎn)移只進(jìn)行2周期化療，4例患者第1周期在本院進(jìn)行，余3個(gè)周期化療當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，其余患者均在本院完成4個(gè)周期的化療。

1.3 隨訪資料（DFS和3年生存率）的收集

均通過電話隨訪，由指定醫(yī)生完成，每3個(gè)月1次。共隨訪70例，失訪3例，隨訪率為95.89%。

1.5 結(jié)果判斷

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用COX模型進(jìn)行單因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)。

3討論

近年來腫瘤的個(gè)體化治療越來越受到從事腫瘤臨床和基礎(chǔ)研究的學(xué)者的重視。NSCLC患者的治療更是需要這一原則。真正意義的個(gè)體化治療是對(duì)每一個(gè)肺癌患者“量體裁衣”，根據(jù)腫瘤生物學(xué)特征和藥物基因組學(xué)改變進(jìn)行針對(duì)性的治療。2006年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表了肺癌個(gè)體化化療里程碑式的文章。在該研究中，只有腫瘤ERCC1蛋白低表達(dá)者可從輔助化療中獲益[2]。

Stathmin是一種微管不穩(wěn)定蛋白，在細(xì)胞周期的不同階段通過磷酸化和去磷酸化作用對(duì)細(xì)胞微管系統(tǒng)動(dòng)力平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮十分重要的作用。通過對(duì)幾種肺癌細(xì)胞的研究表明，微管的聚合狀態(tài)能夠影響其與化療藥物的結(jié)合。增加微管的聚合狀態(tài)能夠增加紫杉醇與微管的結(jié)合，減少長春堿與微管的結(jié)合，從而影響肺癌患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)[3]。蒲驍麟等[4]報(bào)道：在晚期NSCLC中，免疫組織化學(xué)方法測得的Stathmin表達(dá)水平與長春瑞濱+順鉑/卡鉑（NP）方案的化療療效負(fù)相關(guān)。但我們的研究結(jié)果表明，Ⅱ期NSCLC術(shù)后標(biāo)本中Stathmin的蛋白表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)，不能作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。其高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比，DFS和OS均無明顯差異。

那么β-tubulin-Ⅲ的表達(dá)水平與長春堿類藥物療效的關(guān)系怎么樣呢？國內(nèi)外用免疫組化方法檢測得到的結(jié)果很不一致，甚至相互矛盾。Seve等[5]研究了術(shù)后接受NP方案輔助化療的ⅠB～Ⅱ期NSCLC或者， 發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中β-tubulin-Ⅲ蛋白高表達(dá)者，其無復(fù)發(fā)生存期和總生存期均優(yōu)于低表達(dá)者。Reiman T探討了JBR.10等4個(gè)臨床試驗(yàn)中1149例已切除NSCLC的患者與β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)水平可以作為預(yù)測患者預(yù)后的指標(biāo)，但并不能作為預(yù)測化療療效的指標(biāo)[6]。我們的研究結(jié)果表明，Ⅱ期NSCLC術(shù)后標(biāo)本中β-tubulin-Ⅲ的蛋白表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)，其高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比，DFS和OS均無明顯差異。

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篇7

【中圖分類號(hào)】R711.74【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B文章編號(hào)：1004-7484（2012）-05-0786-02宮頸癌發(fā)病與很多因素有關(guān)。筆者對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行輔助檢查，以研究TRAIL、Survivin兩項(xiàng)指標(biāo)在宮頸病變患者疾病中的表達(dá)和其與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，并進(jìn)行分析，現(xiàn)總結(jié)如下：1.對(duì)象與方法

1.1對(duì)象：收集2007年-2010年北京市順義區(qū)醫(yī)院74例患者的標(biāo)本，都為進(jìn)行陰道鏡室活檢及手術(shù)切除的標(biāo)本。輔助病理檢查均明確診斷，27例患者為宮頸浸潤癌設(shè)為宮頸癌組。22例患者為CINII-III級(jí)設(shè)為CIN II-III級(jí)組；25例患者為CIN I級(jí)設(shè)為CIN I級(jí)組。并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行研究，對(duì)照組15例患者為筆者所在醫(yī)院宮頸正常的患者，其標(biāo)本為子宮肌瘤手術(shù)切除標(biāo)本。所有宮頸癌患者在手術(shù)之前都沒有進(jìn)行化療、放療的治療。RT-PCR方法檢測Survivin、TRAIL的表達(dá)，采用SPSSll.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

1.2結(jié)果：宮頸癌組的Survivin基因的表達(dá)指標(biāo)l.293±0.438，CIN II-III級(jí)組為1.010±0.367，CIN I級(jí)組為0.718±0.205，正常宮頸組為0.596±0.229。結(jié)果顯示正常宮頸組明顯低于CIN組，CIN組明顯低于宮頸癌組。CIN I級(jí)組指標(biāo)明顯低于CINII-III級(jí)組，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)。CINI級(jí)組和正常宮頸組比較無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

宮頸癌組TRAIL基因的表達(dá)指標(biāo)為0.441±0.117，CIN II-III級(jí)組為0.536±0.150，CIN I級(jí)組為0.675±0.211，正常宮頸組為0.940±0.427。宮頸癌組和CIN II-III級(jí)組的指標(biāo)明顯高于正常宮頸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：對(duì)宮頸癌組織中的各項(xiàng)表達(dá)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)用Spearman等級(jí)處理，其呈負(fù)相關(guān)關(guān)系表現(xiàn)。相關(guān)系數(shù)r=-0.541，P

在人體腫瘤的研究中，Survivin基因在此疾病的檢查中都有明顯表現(xiàn)。其高度表達(dá)可讓患者的細(xì)胞凋亡受到抑制，從而致使患者的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖異常的表現(xiàn)。這表明此指標(biāo)和患者發(fā)生腫瘤疾病有著很大的關(guān)聯(lián)。筆者應(yīng)用RT-PCR的方法對(duì)患者的標(biāo)本進(jìn)行檢查，經(jīng)對(duì)比分析顯示此指標(biāo)在早期宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化的時(shí)候可能會(huì)高表達(dá)。分析結(jié)果還顯示其和宮頸癌疾病地發(fā)生有很大的關(guān)系。

TRAIL指標(biāo)為腫瘤壞死因子，其本身在正?；颊唧w內(nèi)為高表達(dá)的表現(xiàn)，其在腫瘤患者及胚胎中的表現(xiàn)為低表達(dá)或者為沒有表達(dá)。本組資料顯示其在宮頸癌組中的表達(dá)指標(biāo)為最少，這表明患者在發(fā)生腫瘤疾病時(shí)TRAIL表現(xiàn)為逐漸地丟失。這表明其和疾病的產(chǎn)生和法則有很大的關(guān)系。故對(duì)其進(jìn)行研究可能會(huì)有新的突破。

篇8

關(guān)鍵詞: 癌，肝細(xì)胞;β-連環(huán)蛋白;免疫組織化學(xué)

摘 要:目的 研究β-連環(huán)蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與原發(fā)性肝細(xì)胞癌分化、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系. 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)63例原發(fā)性肝細(xì)胞癌石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行β-連環(huán)蛋白半定量檢測. 結(jié)果 有49例（78%）原發(fā)性肝細(xì)胞癌β-連環(huán)蛋白陽性表達(dá)，低分化癌的β-連環(huán)蛋白陽性率明顯高于高分化癌（P

Keywords:carcinoma，hepatocellular;β-Catenin;immuno-histochemistry

Abstract:AIM To investigate theβ-Catenin expression in primary hepatocellular carcinoma and its relation ship with tumor differentiation，AFP level，invasion，metastasis and prognosis.METHODS β-Catenin expression was detected in63cases of primary hepatocellular carcinoma by using im-munohistochemical technique（DAB method）.RESULTS Expression ofβ-Catenin in77.89%cases of primary hepato-cellular carcinoma and15%cases of liver cirrhosis was stronger than that in the surrounding normal liver tissue.The positivity rate ofβ-Catenin was higher in poorly differen-tiated carcinoma group than that in well differentiated group（P

0 引言

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制和發(fā)病原因至今未明.已有報(bào)道，一些細(xì)胞因子在正常細(xì)胞中異常表達(dá)，或正常細(xì)胞內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)的某些因子反而出現(xiàn)聚集狀態(tài)，將啟動(dòng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，直接或間接地影響核內(nèi)某些基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖過度，引發(fā)腫瘤［1，2］ .

β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）作為細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，既是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵調(diào)控因子，又與細(xì)胞間粘附作用有關(guān)，而這兩種作用與腫瘤發(fā)生、發(fā)展均有密切關(guān)系［3］ .已有報(bào)道稱在大腸癌、肺癌、腎癌等腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)β-Catenin表達(dá)增加［4-6］ ，但其在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義的報(bào)道在國內(nèi)還很少.我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測63例原發(fā)性肝細(xì)胞癌石蠟包埋標(biāo)本中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，并探討其臨床意義，為防治提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 1988/2001第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院普外科手術(shù)切除的原發(fā)性肝細(xì)胞癌病例標(biāo)本63（男46，女17）例，年齡36～72（平均55）歲.按1991年WHO病理分類標(biāo)準(zhǔn)，肝細(xì)胞肝癌63例，其中Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)33例，其中手術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)肝外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例.另取肝硬化20例，正常肝組織10例.

1.2 試劑 兔抗人β-catenin多克隆抗體（附陽性對(duì)照片）、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒均為武漢博士德生物制品公司產(chǎn)品.

1.3 方法 標(biāo)本均經(jīng)40g?L-1 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色及免疫組化染色，切片常規(guī)脫蠟至水，H2 O

2 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉，分別滴加β-catenin一抗，4°C過夜，滴加生物素化二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片，將β-catenin染色陽性的肝癌組織作為陽性對(duì)照，空白對(duì)照選擇PBS代替一抗.

1.4 βCatenin染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞分布范圍分為3個(gè)等級(jí):全片未見著色或極少量細(xì)胞散在著色為（-），胞質(zhì)和胞膜棕黃色著色為陽性，10%～30%細(xì)胞著色但鏡下易觀察到為（+），大于30%細(xì)胞清晰著色為（）.

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:免疫反應(yīng)結(jié)果及其臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2 檢驗(yàn)，生存率計(jì)采用壽命表法，不同分組間生存率差異使用時(shí)序檢驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 βCatenin在HCC中表達(dá)的臨床病理學(xué)特點(diǎn) β-Catenin以膜定位為主，在10例正常肝組織中無1例陽性表達(dá);20例肝硬化組織中僅3例（15%）呈（+），且主要定位于肝細(xì)胞膜的接觸面和膽小管面，未見肝細(xì)胞的血竇面和胞質(zhì)著色;而63例HCC中有49例（78%）標(biāo)本β-Catenin呈陽性表達(dá)，且36例為（）表達(dá)，主要定位于肝癌細(xì)胞的外周胞質(zhì)、血竇面、接觸面和腺腔面.胞質(zhì)β-Catenin陽性著色為點(diǎn)狀著色或片狀淺著色，胞膜β-Catenin陽性著色為不規(guī)則線狀或顆粒狀著色.在靠近毛細(xì)胞膽管腔面和小膽管腔面常見肝癌細(xì)胞陽性深著色.β-Catenin的分布呈異質(zhì)性:有大片細(xì)胞廣泛表達(dá)，小片細(xì)胞區(qū)域表達(dá)，散在表達(dá)或大片細(xì)胞中僅數(shù)個(gè)細(xì)胞表達(dá)（Fig1，2）.肝癌組織和非肝癌組織的β-Catenin表達(dá)亦呈異質(zhì)性:肝癌組織β-Catenin表達(dá)為外周胞質(zhì)點(diǎn)狀或片狀淺著色，粗大的胞膜不規(guī)則線狀、點(diǎn)狀著色，偶見胞核深染;而非肝癌組織大都陰性表達(dá)，或少量的胞膜線狀、點(diǎn)狀著色.β-Catenin的表達(dá)與腫瘤的分化程度呈反比，即分化差時(shí)β-Catenin的表達(dá)趨于增多.Ⅰ級(jí)中（-）8例、（+）表達(dá)1例、（）表達(dá)5例;Ⅱ級(jí)中（-）2例、（+）表達(dá)5例、（）表達(dá)9例;Ⅲ級(jí)中（-）4例、（+）表達(dá)7例、（）表達(dá)22例.3組比較，差異有顯著性（P

2.2 βCatenin與患者AFP水平及預(yù)后的關(guān)系 β-Catenin的陽性表達(dá)與HCC患者AFP水平呈正比，即AFP水平越高者β-Catenin陽性表達(dá)越強(qiáng)，AFP400μg?L-1 組分別為3，8，23例.二組之間存在顯著性差異（P

3 討論

HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多因素影響、牽涉多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑的復(fù)雜過程.Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常是目前研究腫瘤發(fā)生機(jī)制的一個(gè)熱點(diǎn).而β-Catenin正是這一傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)［7］ .本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，49/63的HCC標(biāo)本中β-Catenin呈陽性表達(dá)，且表達(dá)程度與HCC的病理分級(jí)、術(shù)后存活時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，與患者AFP水平，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān).表明β-Catenin在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用不容忽視.β-Catenin被發(fā)現(xiàn)是一種與跨膜粘附分子鈣粘著素（Cadherin）相連的胞內(nèi)特異蛋白，以復(fù)合體形式存在于各類上皮和某些實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，介導(dǎo)細(xì)胞間連接，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，β-Catenin作為一種關(guān)鍵Wnt蛋白，與APC，GSK-3β復(fù)合、解離、胞質(zhì)積累、入核，作用于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄［8-11］ ，或刺激增殖，或抑制凋亡，從而認(rèn)為β-Catenin是一種癌基因［12］ .其致癌機(jī)制可能是發(fā)生在氨基端的突變使變異的β-Catenin大量積累而激活了轉(zhuǎn)錄因子.Yi等［13］ 報(bào)道β-Catenin/APC介導(dǎo)的Wnt途徑的突變占肝癌發(fā)生的30%.關(guān)于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)β-Catenin表達(dá)增加的原因，目前的看法主要是其降解減緩，而非生成增加.影響β-Catenin降解的因素有Wnt信號(hào)的增強(qiáng)，APC的突變以及β-Catenin本身的突變等.在Rubinfeld等［14］ 對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系的研究中，發(fā)現(xiàn)β-Ccatenin的增加主要與其本身的突變有關(guān)，β-Catenin突變后可增加其穩(wěn)定性，使其不被降解.Wnt信號(hào)的增強(qiáng)可以抑制APC對(duì)β-Catenin的降解作用.此外，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，3個(gè)大腸癌細(xì)胞系中均有β-Catenin表達(dá)的增強(qiáng)，認(rèn)為大腸癌癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化與β-Catenin靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄關(guān)系密切，β-Catenin的靶基因可能就是大腸癌的癌基因

［15］ .

本研究結(jié)果顯示，β-Catenin在腫瘤較靠近血竇、毛細(xì)膽管處表達(dá)較強(qiáng)，同時(shí)與腫瘤病理分級(jí)負(fù)相關(guān)，提示可以將β-Catenin作為分化差、易浸潤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物;β-Catenin表達(dá)與AFP表達(dá)相關(guān)，可以協(xié)同原發(fā)性肝癌的臨床診斷;手術(shù)標(biāo)本中β-Catenin的表達(dá)情況可以作為判斷患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo).

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篇9

【關(guān)鍵詞】 腎腫瘤 Np63 原癌基因蛋白質(zhì)cmdm2 免疫組織化學(xué)

［ABSTRACT］ Objective To explore the expressions of Np63 and MDM2 proteins in renal cell carcinoma (RCC) and their relationship with the tumor invasion and metastasis. Methods Using immunohistochemical method， Np63 and MDM2 in 76 RCC， and 14 normal renal tissues were detected. Results The expressions of Np63 and MDM2 in RCC and in normal renal tissue showed significantly different between them (F=28.34，22.57;q=6.471-12.529;P0.05)， but related to clinical staging (F=24.59，10.82;q=4.694-11.971；P

［KEY WORDS］ Kidney neoplasms; Np63; Protooncogene proteins cmdm2; Immunohistochemistry

腎細(xì)胞癌是人類泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈增高趨勢。分子生物學(xué)研究表明，其能預(yù)測腫瘤的生物學(xué)行為，為腫瘤的診斷和治療及術(shù)后檢測提供新的依據(jù)。本研究旨在通過免疫組織化學(xué)方法觀察Np63和MDM2蛋白在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其意義，探討二者在腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，從而為臨床早期判斷腎癌的生物學(xué)行為和尋求新的治療途徑提供參考資料?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)組76例標(biāo)本均為我院2000～2006年間手術(shù)切除的腎細(xì)胞癌標(biāo)本。其中男46例，女30例；年齡34～85歲，平均56.2歲。病理學(xué)分型為：透明細(xì)胞癌48例，嗜色細(xì)胞癌10例，嫌色細(xì)胞癌5例，未分類型及其他13例。ROBSON分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期29例，Ⅲ期14例，Ⅳ期17例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。對(duì)照組14例腎組織均取自離腫瘤2 cm以上的正常腎組織。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及來源

小鼠抗人MDM單克隆抗體（Dako 公司），Np63鼠抗人單克隆抗體濃縮液(Santa Cruz公司)，SP免疫組化試劑盒（通用型），DAB顯色試劑盒，EDTA抗原修復(fù)緩沖液和檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（福建邁新公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01 mmol/L PBS沖洗5 min，共3次。根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)（其中P63為檸檬酸，pH 6.0修復(fù)，MDM2為EDTA，pH 8.0修復(fù)）。每張切片滴加體積分?jǐn)?shù)為0.03的H2O2雙蒸水溶液，室溫下放置10 min，用PBS振洗5 min，共3次。滴加正常非免疫動(dòng)物血清，室溫放置10min，甩去多余液體不洗。滴加適當(dāng)稀釋的一抗（P63為1∶100，MDM2為1∶75），于濕盒內(nèi)室溫下放置1 h，PBS振洗5 min，共3次。滴加生物素化二抗，置濕盒內(nèi)室溫放置15 min，PBS振洗5 min，共3次。滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶溶液，置濕盒內(nèi)室溫放置15 min，PBS振洗5 min，共3次。DAB顯色，鏡下觀察，自來水沖洗中止顯色。復(fù)染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別采用已知的陽性切片和PBS代替一抗，步驟與前相同。

1.2.3 結(jié)果判定

利用德國Simple PCI 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度測量，將免疫組化染色結(jié)果轉(zhuǎn)化為灰度值進(jìn)行定量分析。每張切片以組織間質(zhì)空白處入射光的值為定標(biāo)，在200倍鏡下每張切片選取5個(gè)視野，分別測定間質(zhì)灰度和腎癌灰度，取其平均值，作為Np63和MDM2蛋白表達(dá)測定值，測定值＝間質(zhì)灰度值-癌組織灰度值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，蛋白表達(dá)之間的相關(guān)分析采用Spearman法。

2 結(jié) 果

2.1 Np63、MDM2蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組中Np63蛋白主要表達(dá)于腎癌細(xì)胞細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，MDM2主要表達(dá)于腎癌細(xì)胞細(xì)胞核；對(duì)照組中Np63和MDM2蛋白少量表達(dá)于近曲、遠(yuǎn)曲腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核。

14例正常腎組織中Np63蛋白表達(dá)測定值為17.67±6.86，MDM2蛋白表達(dá)的測定值為14.15±5.24。腎癌組織與正常腎組織中Np63、MDM2蛋白的表達(dá)差異有顯著意義（F=28.34、22.57，q=6.471～12.529，P0.05）；不同臨床分期腎癌組織中Np63、MDM2蛋白的表達(dá)差異有顯著性（F=24.59、10.82，q=4.694～11.971，P

轉(zhuǎn)貼于

2.2 Np63、MDM2之間的關(guān)系

Np63和MDM2蛋白的表達(dá)存在著顯著相關(guān)性（rs=0.513，P

3 討 論

Np63（缺乏酸性N端反式激活區(qū)的截短型p63）是p63基因的一類亞型，對(duì)p63的研究表明，p63的結(jié)構(gòu)是p53家族中最為復(fù)雜的，p63基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的作用因其結(jié)構(gòu)不同而不同。它能夠參與DNA 結(jié)合位點(diǎn)的競爭或直接與p53 或TA p53（酸性N端反式激活區(qū)的全長型p63）結(jié)合而滅活p53 或TA p53的功能，從而阻止p53 基因和TA 亞型所誘導(dǎo)的細(xì)胞周期抑制和發(fā)生凋亡[1]。PATTURAJAN等[2]研究表明，Np63的過表達(dá)介導(dǎo)了β鏈蛋白的磷酸化水平降低，后者又反過來誘導(dǎo)鏈蛋白核積聚和活化了β鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑。正因?yàn)镹p63異構(gòu)體是β鏈蛋白信號(hào)途徑的正向調(diào)節(jié)因子，才使得NP63異構(gòu)體具有致癌的特性。本文結(jié)果顯示，腎細(xì)胞癌Np63的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，推測Np63表現(xiàn)出來的是癌基因的功能，可能具有啟動(dòng)特定突變體腫瘤發(fā)生的生物特性，并為癌細(xì)胞的存活提供有利條件。Np63的表達(dá)隨ROBSON分期增高而增加，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Np63的表達(dá)要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。提示Np63在腎細(xì)胞癌的形成、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。本文結(jié)果還顯示，在不同病理類型的腎癌組織中Np63的表達(dá)差異無顯著性，考慮其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用可能是一樣的。

已有研究結(jié)果表明，MDM2與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。MDM2基因最初是由CAHILLYSNYDER等[4]在自發(fā)腫瘤鼠Balb/c3T3成纖維細(xì)胞系中鑒定出來的。MDM2體內(nèi)最重要的作用是抑制野生型p53（wtp53）基因的激活轉(zhuǎn)錄功能和抗腫瘤活性。其主要通過與p53形成復(fù)合物或加速p53的分解，而高水平的MDM2基因產(chǎn)物本身也可以使p53的功能失活，抑制p53的功能，對(duì)p53起負(fù)調(diào)節(jié)的作用[5，6]。本文結(jié)果顯示，腎細(xì)胞癌MDM2的表達(dá)要明顯高于正常對(duì)照組，推測MDM2表達(dá)過強(qiáng)可封閉p53介導(dǎo)的反式激活作用，使p53功能喪失，導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定及細(xì)胞增生，從而表現(xiàn)出癌基因蛋白的作用，參與腫瘤形成。MDM2的表達(dá)隨ROBSON臨床分期增高而增加，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)DM2表達(dá)要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示MDM2參與腎細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，Np63和MDM2都與p53存在密切的聯(lián)系。而兩者在對(duì)p53的作用上機(jī)制不同，但作用結(jié)果是一致的，兩者在腎細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中應(yīng)該是起協(xié)同作用的。

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【摘要】 目的：研究paxillin和survivin基因蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，了解其臨床意義。方法：用免疫組織化學(xué)sp法檢90例結(jié)直腸癌組織及30例正常腸黏膜、30例腸腺瘤的paxillin和survivin基因蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：結(jié)直腸癌組織paxillin的陽性表達(dá)率為77.8%，高于腺瘤的50.0%和正常腸黏膜的23.3%(p<0.05，p<0.01);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的paxillin陽性表達(dá)率為88.0%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的65.0%(p<0.01);生存期<5 a paxillin 陽性表達(dá)率為90.9%，高于生存期≥5 a的60.5%(p<0.01)。結(jié)直腸癌survivin蛋白陽性表達(dá)率為75.6%，高于腺瘤的16.7%和正常腸黏膜的10.0%(均有p<0.01);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的survivin蛋白陽性表達(dá)率為90.0%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為57.5%(p<0.01);生存期<5 a survivin蛋白陽性表達(dá)率為100%，高于生存期≥5 a的67.4%(p<0.01)。結(jié)論：paxillin和survivin在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，陽性率越高，越易轉(zhuǎn)移，預(yù)后越差。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸腫瘤;paxillin;survivin; 轉(zhuǎn)移;預(yù)后;免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌是發(fā)病率最高的消化道腫瘤之一，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多個(gè)基因和多種分子變化。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到從腸黏膜正常上皮經(jīng)過腺瘤到腸癌，上皮細(xì)胞涉及了多重基因的遺傳及表遺傳學(xué)改變。其中細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞骨架蛋白在腸黏膜各級(jí)病變中起著重要的作用。近年的研究表明，惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移除了細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和細(xì)胞的移行，還有細(xì)胞骨架蛋白的重建和重組。paxillin(樁蛋白)是個(gè)黏著斑相關(guān)蛋白，具有接頭蛋白的活性，在細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，是很多不同癌蛋白的共同靶點(diǎn)。survivin是凋亡抑制蛋白家族iaps中最小、作用最強(qiáng)的一個(gè)新成員，它既能抑制細(xì)胞的凋亡[1]，又能調(diào)控細(xì)胞周期[2]，在正常胚胎發(fā)育過程中有所表達(dá)，但在成人終末分化中很少見到(除了、胎盤和胸腺外)，卻在大量惡性腫瘤組織如胃癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等表達(dá)。為了解paxillin和survivin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響，我們采用免疫組化sp法對(duì)結(jié)直腸癌組織中paxillin和survivin蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并探討它們與結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集廣東廉江市人民醫(yī)院和廣東湛江中心人民醫(yī)院2001年1月至2002年12月手術(shù)后的結(jié)直腸癌組織90例，腺瘤組織30例，并取30例遠(yuǎn)離癌灶5 cm以上沒有癌浸潤的正常大腸黏膜作對(duì)照。90例結(jié)直腸癌中，男52例，女38例，年齡26歲～70歲，平均年齡為(46±11)歲。所有患者術(shù)前均未行放療及化療。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組50例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組40例。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，行he染色和免疫組化sp法染色。

1.2 方法 免疫組化染色采用sp法，第一抗體paxillin、survivin以及sp試劑盒均購自福州邁新公司。切片均進(jìn)行微波抗原修復(fù)。染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性片作陽性對(duì)照，用pbs代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 paxillin的陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色。survivin陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。以陽性細(xì)胞數(shù)占全部腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比分級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～50%為(++)，>50%為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 paxillin在結(jié)直腸黏膜病變中的表達(dá)情況 見表1。從表1可以看到，結(jié)直腸癌組織中paxillin的陽性表達(dá)率為77.8%(70/90)，正常腸黏膜中paxillin的陽性表達(dá)率為23.3%(7/30)，兩者比較，差異有高度顯著性(p<0.01);而腺瘤組織中paxillin的陽性表達(dá)率介于癌和正常腸黏膜之間，為50.0%(15/30)，分別與此兩者比較，差異均有顯著性(p<0.05)。

表1 paxillin在結(jié)直腸腸黏膜病變中的表達(dá)(略)

2.2 結(jié)直腸癌組織中paxillin的陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 見表1。90例結(jié)直腸癌中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的50例，paxillin的陽性表達(dá)率為88.0%(44/50)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的40例，paxillin的陽性表達(dá)率為65.0%(26/40),兩者比較，差異有高度顯著性(p<0.01)。

2.3 結(jié)直腸癌組織中paxillin的陽性表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 見表2。本組90例結(jié)直腸癌患者中，有65例有隨訪資料，生存期≥5 a的paxillin陽性表達(dá)率為60.5%(26/43)，而生存期<5 a paxillin 陽性表達(dá)率為90.9%(20/22)，兩者比較，差異有高度顯著性(p<0.01)。

表2 結(jié)直腸癌組織中paxillin的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系(略)

結(jié)直腸癌組織中survivin蛋白的表達(dá)：90例結(jié)直腸癌組織中有68例survivin蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為75.6%。而30例正常腸黏膜僅有3例survivin蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為10.0%;兩者比較，有高度顯著性差異(p<0.01)。腺瘤的survivin蛋白陽性表達(dá)率為16.7%(5/30)，與正常腸黏膜的差異不大，與癌的比較差異有高度顯著性(p<0.01)。

2.4 結(jié)直腸癌組織中survivin蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 見表3。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中survivin蛋白陽性表達(dá)率為90.0%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為57.5%，兩者差異有高度顯著性(p<0.01)。

表3 結(jié)直腸癌中survivin蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系(略)

2.5 結(jié)直腸癌組織中survivin蛋白的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 見表4。90例結(jié)直腸癌患者中，有65例有隨訪資料，生存期≥5 a的survivin蛋白陽性表達(dá)率為67.4%(29/43)，而生存期<5 a survivin蛋白陽性表達(dá)率為100.0%(22/22)，兩者比較，差異有高度顯著性(p<0.01)。

表4 結(jié)直腸癌組織中survivin蛋白的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系(略)

3 討論

3.1 paxillin是近年來發(fā)現(xiàn)的含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，是整合素家族下游重要的銜接分子，使一些結(jié)構(gòu)和信號(hào)分子結(jié)合至黏著斑，構(gòu)成黏著斑的重要組成部分 paxillin既參與整合蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，也參與黏著斑的組裝，在細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移中起重要作用。paxillin有參與動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)焦點(diǎn)黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞的移動(dòng)和播散等功能;而癌的浸潤和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞的黏附力、移動(dòng)力的改變直接相關(guān)，所以paxillin與癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移必有聯(lián)系。國內(nèi)學(xué)者潘勝利等[3]研究paxillin在肝癌中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在肝癌中paxillin的表達(dá)降低。田素芳等[4]在研究paxillin在胃腺癌中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織分化越低，paxillin的表達(dá)越高;胃癌分期越晚，paxillin的表達(dá)越高。但張春宏等[5]的報(bào)道卻相反，他們認(rèn)為，胃癌中paxillin的表達(dá)比正常胃黏膜的低，隨著分化降低、浸潤廣泛和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，paxillin的表達(dá)越來越低。本文研究發(fā)現(xiàn)，在正常腸黏膜，paxillin的表達(dá)水平最低(23.3%)，腸腺瘤的較高(50.0%)，而結(jié)直腸癌的最高(77.8%);而且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的paxillin的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的，生存期<5 a的paxillin陽性表達(dá)率顯著高于生存期≥5 a的。這些提示paxillin的高表達(dá)率與結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，paxillin的高表達(dá)率是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的因素之一。這結(jié)論與楊等[6]結(jié)果相同。

3.2 惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的凋亡失去抑制有關(guān) 凋亡抑制基因家族龐大，survivin作為凋亡抑制基因家族的一個(gè)新成員，是至今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，它可抑制細(xì)胞的凋亡，與細(xì)胞的增殖、分裂和細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。國外有學(xué)者研究表明，survivin廣泛表達(dá)于人類胚胎發(fā)育組織和大多數(shù)惡性腫瘤組織，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。survivin通過抑制凋亡通路下游的caspase3和caspase7發(fā)揮抗凋亡作用[8]。本組研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中survivin基因呈高表達(dá)，陽性表達(dá)率達(dá)75.6%，而正常腸黏膜組織中陽性率僅為10.0%;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者survivin陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示survivin基因的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。隨訪結(jié)果顯示，<5 a生存期的survivin陽性率比>5 a生存期的高，提示患者的生存期隨survivin陽性率的增高而縮短。本文結(jié)果與李春生等[9]報(bào)道相似。

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